Prevalencia de infección por Entamoeba Histolytica en escuelas públicas de la ciudad de Maceió, Alagoas, Brasil.
INTRODUCCION
Al microscopio óptico, apenas existen diferencias morfológicas entre los quistes de Entamoeba histolytica, especie patógena responsable de la amebiasis, y de Entamoeba dispar, especie no patógena. Como ha sido reportado que la infección por E. dispar es aproximadamente 10 veces más frecuente que la infección por E. histolytica,
la detección diferencial entre estas dos especies tiene
implicaciones epidemiológicas. El uso de la microscopia óptica para
el diagnóstico de infección por E. histolytica puede resultar en una sobredimensión de la prevalencia de amebiasis y en tratamientos innecesarios. Debido a la imposibilidad de discriminar entre las dos especies por
sus características morfológicas, la Organización Mundial de la Salud
(OMS) recomienda que los resultados positivos de los exámenes
coproparasitológicos sean registrados como E. histolytica/E. dispar. Por igual motivo, se recomienda la realización de procedimientos que permitan la detección específica de E. histolytica y que solo cuando ello haya ocurrido se administre el tratamiento amebicida correspondiente. E. histolytica y E. dispar
pueden ser diferenciadas mediante el uso de procedimientos
bioquímicos, inmunológicos y moleculares. De ellos, las pruebas
inmunológicas basadas en la detección de coproantígenos presentan una
buena sensibilidad y adecuada correlación clínica.
En
Brasil, la prevalencia de amebiasis varía de acuerdo con la región
del país donde se realizó el estudio. Empleando procedimientos
inmunológicos, los índices más elevados han sido reportados en Belém,
Estado de Pará (región norte), donde afecta 29 % de la población; y en Fortaleza, Estado de Ceará (región nordeste), que la infección
estaba presente en 10,6 % de las personas pesquisadas. Sin embargo, en Pernambuco (región nordeste), también empleando
herramientas inmunológicas, no fueron detectados casos de infección
por E. histolytica.
Hasta el presente, en el Estado de Alagoas (región nordeste) no se
han realizado estudios para verificar, con la utilización de métodos
inmunológicos, la ocurrencia de infección por E. histolytica.
Los objetivos del presente trabajo fue determinar, mediante el empleo
de procedimientos microscópicos y el ensayo inmunoenzimático
ENZYMEBA, la prevalencia de infección por el complejo Entamoeba histolytica/E. dispar, y precisar, mediante la utilización de la prueba inmunoenzimática E. histolytica II, la prevalencia de la infección por la especie Entamoeba histolytica en escuelas públicas de la ciudad de Maceió, Estado de Alagoas, Brasil.
MÉTODOS
Diseño del estudio
Se
realizó un estudio transversal a estudiantes de escuelas públicas de
la ciudad de Maceió, Alagoas, Brasil, entre marzo de 2004 y mayo de
2005.
Muestreo
El
método de muestreo fue equiprobabilístico en varias etapas: a) una
estratificación por área administrativa se estratificaron
proporcionalmente las escuelas en tres áreas, representativas de cada
área geográfica en que se divide la ciudad de Maceió; b) una
estratificación por tamaño de la escuela cada área fue dividida en
dos estratos (uno correspondiente a las escuelas con menos de 500
estudiantes, otro correspondiente a las escuelas con 500 alumnos o más);
c) se seleccionaron al azar tres escuelas en cada estrato, con
probabilidad proporcional al número de estudiantes.
Selección de estudiantes
Participaron
en el estudio todos los estudiantes de 4 a 15 años que recibían
clases en el horario de la mañana en las escuelas seleccionadas y
cuyos padres firmaron el correspondiente consentimiento informado. Se
colectó una muestra fecal de cada estudiante.
Tamaño de la muestra
Para
calcular el tamaño de la muestra se consideró una frecuencia
esperada de 8,0 % (observada en estudios preliminares, con el error
tolerable de 15 % y un intervalo de confianza de 95 %. El tamaño
mínimo de la muestra se estimó en 1 670 alumnos, distribuidos
proporcionalmente en las tres áreas.
Microscopia
Todas
las muestras fecales (una por cada estudiante) se procesaron
utilizando la técnica de concentración de formol-éter para
identificación de quistes. De cada muestra se prepararon cinco frotis
que fueron examinados al microscopio óptico por técnicos diferentes.
Las heces fueron clasificadas de acuerdo con los resultados del examen
microscópico como positiva o negativa al complejo E. histolytica/E. dispar. Las muestras positivas se conservaron a - 20 °C para la realización de ensayos inmunoenzimáticos.
Ensayos inmunoenzimáticos
Se
utilizaron dos procedimientos inmunoenzimáticos: ENZYMEBA (Instituto
de Medicina Tropical «Pedro Kourí», La Habana, Cuba) y E. histolytica II(TechLab Inc., Blacksburg, EE.UU.). En ambos casos, para su
realización se siguieron las instrucciones de sus productores.
ENZYMEBA se basa en la captura de histolisina, proteasa secretada por
amebas de las especies E. histolytica y E. dispar.
Este ensayo, por tanto, es capaz de detectar, pero no diferenciar,
la infección por estas dos especies. A las muestras de heces
positivas al complejo E. histolytica/E. dispar mediante examen
microscópico, se les realizó el procedimiento ENZYMEBA para
confirmar ese resultado y con ello evitar falso positivo, que suelen
ser frecuentes a la observación morfológica. La prueba E. histolytica II
es un inmunoensayo basado en la interacción de anticuerpos
monoclonales con determinantes antigénicos solo presentes en la
adhesina con afinidad a galactosa de E. histolytica. En consecuencia, este procedimiento solo detecta la infección por esta especie amebiana.
Definición de caso de amebiasis
Se consideraron portadores del complejo E. histolytica/E. dispar los
estudiantes cuyas heces resultaron positivas a la observación
microscópica y al inmunoensayo ENZYMEBA. Se clasificaron casos de
amebiasis los alumnos cuyas heces fueron positivas al inmunoensayo E. histolytica II.
Análisis estadístico
Se
utilizó el programa Epi-Info 6.04 para la compilación de todos los
datos obtenidos. Empleando este programa se calculó el valor
predictivo positivo (VPP) del examen de heces para el diagnóstico de
amebiasis, asumiendo como referencia la prueba E. histolytica II.
Aspectos éticos
A
los padres de los estudiantes se les informó sobre los objetivos de
la investigación y, después de recibir respuestas a preguntas hechas a
miembros del equipo realizador, firmaron el correspondiente
consentimiento informado. El proyecto de este trabajo fue
aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad
Federal de Alagoas (Proyecto 009057/02-95). Todos los niños
encontrados parasitados se evaluaron y trataron por médicos
especialistas.
RESULTADOS
Se
analizaron muestras fecales de 1 798 estudiantes de 18 escuelas
públicas de la ciudad de Maceió. De los estudiantes encuestados, 51,4
% eran hembras y 48,6 % varones.
En
68 (3,8 %) de las 1 798 muestras fecales analizadas por microscopia
óptica se detectó la presencia de amebas del complejo E. histolytica/E. dispar.
Estas 68 muestras también fueron positivas al inmunoensayo ENZYMEBA,
lo que confirma la presencia en ellas de amebas del mencionado
complejo. La realización de la prueba E. histolytica II a las 68 muestras positivas al examen microscópico y a ENZYMEBA demostró la infección por E. histolytica en 18 (26,5 %) individuos. Es decir, la infección por E. histolytica estaba presente en 18 (1,0 %) de los 1 798 de los estudiantes trabajados.
La frecuencia de infección por el complejo E. histolytica/E. dispar fue mayor con el aumento de la edad de los alumnos (p< 0,05), mientras que la frecuencia de parasitismo por E. histolytica resultó significativamente mayor en los grupos de edades más jóvenes (p< 0,05) . La prevalencia de infección por el complejo E. histolytica/E. dispar y por E. histolytica fue similar para los 2 sexos (p> 0,05).
DISCUSIÓN
Por
su relativo bajo costo de realización, su disponibilidad en
prácticamente todas las unidades de la mayoría de los sistemas de
salud y porque permite la detección de otras infecciones parasitarias
en el mismo ensayo, la observación microscópica de heces es el
examen más utilizado para el diagnóstico de la amebiasis intestinal.16 Sin embargo, este procedimiento tiene limitaciones a las que se hace referencia a continuación:
- Con relativa frecuencia se confunden trofozoítos amebianos con
leucocitos, de manera particular con macrófagos que han fagocitado
hematíes, y quistes de unas amebas con los de otras. Esta
limitación para realizar una adecuada detección microscópica
conduce, en no pocas ocasiones, a resultados falsos positivos. Por ese
motivo, en este estudio se utilizó el ensayo ENZYMEBA para
confirmar los casos de infección por el complejo E. histolytica/E. dispar (este procedimiento, sin embargo, no permite discriminar entre infección por E. histolytica e infección por E. dispar).
- Otra de las insuficiencias del examen microscópico es su incapacidad para diferenciar entre quistes de E. histolytica y quistes de E. dispar, lo que puede ser otra fuente de sobrediagnóstico de amebiasis intestinal.Varios estudios muestran que el VPP del diagnóstico microscópico de amebiasis es muy bajo. Nesbitt y otros compararon los resultados de la observación microscópica y una prueba de ELISA específica para la detección de E. histolytica
en 842 muestras de heces y encontraron para la primera una
sensibilidad de 43 % y un VPP de 5 %. En el presente trabajo, el VPP del
examen microscópico fue similar al obtenido en un estudio
realizado en Canadá (27,3 %), en el que se emplearon como pruebas
de referencia dos ensayos de ELISA. Por tanto, con los resultados de nuestra serie se confirma que ante un resultado positivo a E. histolytica/E. dispar
por examen microscópico de heces no debe hacerse el diagnóstico de
amebiasis, sin la realización de pruebas diagnósticas
complementarias que permitan la detección específica de infección
por E. histolytica.
De acuerdo con las recomendaciones de la Organización Mundial para la Salud (OMS), el diagnóstico de amebiasis debe ser realizado por la aplicación de pruebas capaces de detectar específicamente E. histolytica. La prueba E. histolytica II detecta la adhesina con afinidad a galactosa de E. histolytica. El uso este ensayo en otros estudios permitió la identificación de E. histolytica con una sensibilidad de 86 a 95 % y una especificidad de 98 a 99 %. En un estudio realizado en Bangladesh, la aplicación de este
procedimiento a muestras de heces de niños resultó más sensible y
específica que la microscopia y el cultivo. En ese mismo trabajo, los autores compararon otras metodologías para la detección de E. histolytica.
La reacción en cadena dela polimerasa (RCP) anidada mostró una
excelente correlación con el cultivo, seguida por el análisis de
isoenzimas y la detección de antígenos de la especie, lo que confirma
la posibilidad de utilizar diferentes técnicas para el estudio de la
infección por E. histolytica. Sin embargo, la detección de antígenos por ELISA fue más rápida y sencilla que el resto de los procedimientos.
Aunque
la observación microscópica no es una herramienta adecuada para el
diagnóstico de la amebiasis, es útil como un método para la
identificación de amebas del complejo E. histolytica/E. dispar, sobre todo en los grandes estudios epidemiológicos. En tales casos, la confirmación de casos de infección por E. histolytica debe realizarse mediante el uso de procedimientos específicos, tales como la prueba E. histolytica II.
En
la casi totalidad de los estudios de diferenciación realizados, la
especie de ameba más frecuente encontrada en los casos de infección
por el complejo E. histolytica/E. dispar es E. dispar, la especie no patógena, para la cual regularmente no se prescribe tratamiento médico. En consecuencia, el incremento de prevalencia de infección por amebas del complejo E. histolytica/E. dispar
con el aumento de la edad de los participantes observado en este
trabajo podría ser consecuencia de la acumulación desde edades
inferiores de individuos infectados por E. dispar.
Por otro lado, ha sido demostrado que la infección intestinal por E. histolytica es más frecuente en edades más tempranas. Este podría ser el motivo por el cual en el presente estudio fue
encontrada mayor frecuencia de infección por esa especie amebiana en
los grupos de edades más jóvenes.
Los resultados de este trabajo, en el que sí pudo ser confirmada la infección por E. histolytica
en parte de los casos estudiados, difieren de los de estudios
previos llevados a cabo en el Estado de Pernambuco, nordeste de
Brasil, donde no pudo ser demostrada la presencia de E. histolytica
en muestras de heces estudiadas mediante la aplicación de técnicas
de análisis de isoenzimas, de detección de antígeno y de biología
molecular. Empleando herramientas inmunológicas y
biomoleculares, tampoco pudo ser demostrada la presencia de esta
especie amebiana en un estudio reciente realizado en la ciudad de
Salvador, Estado de Bahía, Brasil.
La redescripción de E. histolytica como un complejo de dos especies (E. histolytica, especie patógena; y E. dispar,
especie no patógena y mayoritaria en la casi totalidad de los
estudios realizados) revolucionó (y revoluciona aún) los
conocimientos sobre la epidemiología de la amebiasis. Los resultados
de nuestro trabajo hacen evidente la necesidad de realizar estudios de
prevalencia de esta parasitosis (que incluyan utilización de
herramientas que permitan la diferenciación de especies) en otras
regiones de Brasil.
Sobrediagnóstico de amebiasis en niños con disentería.
INTRODUCCIÓN
En la región centro-norte de la provincia de Santa Fe es frecuente encontrar informes parasitológicos positivos para Entamoeba histolytica en niños con disentería. Allí, pacientes con diarreas sanguinolentas reciben metronidazol
(aun sin determinaciones de laboratorio), porque se presume que
tienen alta posibilidad de padecer una enfermedad amebiana por la
zona en la que habitan.
En otras regiones del país también se identificó a E. histolytica como el patógeno más frecuente en pacientes con diarreas mucosanguinolentas, muchas veces, asociado a Shigella spp.
Los diagnósticos de amebiasis intestinal se realizan, habitualmente,
con los mismos criterios morfológicos vigentes hasta fines del
siglo XX, a pesar de que han perdido validez desde que se comprobó
que existen dos especies de amebas. Éstas resultan idénticas al
microscopio, pero poseen diferencias bioquímicas, genéticas e
inmunológicas que determinan que una, E. histolytica, pueda comportarse como patógena, y la otra, Entamoeba dispar, sea inofensiva.
Estas amebas pueden diferenciarse mediante: a) la observación, en
un examen directo, de la capacidad que tienen los trofozoítos de E. histolytica
para fagocitar hematíes; b) los cultivos con análisis de zimodemos;
c) la detección de material genético por medio de la prueba de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la pesquisa en muestras fecales de una enzima específica de E. histolytica, la galactosa-adhesina, mediante una prueba de inmunoanálisis (ELISA).
Se planteó la hipótesis de que, en nuestra región, era probable
que muchos de los casos tratados como disenterías amebianas no lo
fueran. Entonces, el objetivo fue precisar el diagnóstico de E. histolytica
mediante la detección de adhesina en heces y determinar su
frecuencia en niños con diagnóstico previo, por observación
microscópica, de disenterías amebianas.
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio observacional, descriptivo y transversal. La población a
estudiar estuvo constituida por pacientes de 2 meses a 15 años de
edad, sin patologías graves asociadas, que consultaron en el
Hospital de Niños "Dr. Orlando Alassia" de Santa Fe (Argentina), con
diagnóstico de disentería y la presencia de Entamoeba histolytica en
un examen parasitológico fecal directo, realizado en el laboratorio
del Hospital o en laboratorios privados de la ciudad de Santa Fe.
Criterios de inclusión: niños mayores de 2 meses y menores de 15
años con diarrea con sangre macroscópica o microscópica e informe
parasitológico directo positivo para E. histolytica/dispar y resultado del E. histolytica test II.
Criterios de exclusión: tratamientos previos con amebicidas, enfermedad grave asociada.
En fichas individuales se registraron los siguientes datos: edad,
sexo, domicilio, fiebre, sangre en heces, leucocitos fecales,
vómitos, dolor abdominal, parásitos asociados, enterobacterias y
ELISA para adhesina de E. histolytica (E. histolytica test II).
Definición de términos: Disentería: diarrea con sangre
macroscópica o en examen microscópico (Modificado de: Disentería.
Diálogo sobre la diarrea. Nº 48 Oct-Dic 1994. AHRTAG, CID,
OPS/OMS). Fiebre: temperatura axilar mayor de 37,2 ºC. Diarrea aguda:
menor de siete días de evolución. Enfermedad grave asociada:
desnutrición grave, neumonía, sepsis, enfermedad intestinal
inflamatoria, invaginación intestinal, fibrosis quística de páncreas,
infección del sistema nervioso central, trastornos de la
coagulación, inmunosupresión.
Los pacientes fueron captados
por los investigadores, en el Servicio de Guardia, cuatro días por
semana. De cada paciente se recogió una muestra de materia fecal,
que se dividió en tres partes.
Una parte fue guardada a menos 20 ºC para investigar la existencia de la enzima adhesina de E. histolytica
(las adhesinas se degradan si la muestra se almacena a temperatura
ambiente). Su presencia se demostró a través de un inmunoanálisis
enzimático, "Entamoeba histolytica II", realizado de acuerdo al procedimiento indicado por el fabricante, (TechLab®
Blacksburg, VA 24060 EE.UU.). Los resultados se interpretaron
visualmente, en los casos positivos el desarrollo de color confirmó
la presencia de los complejos enzima-antígenoanticuerpo. Fueron
comparados con pocillos de control, tanto positivos como negativos.
Cuando en una reacción negativa, con el microscopio se vieron
quistes y/o trofozoítos de E. histolytica/ dispar, se consideraron como E. dispar.
Otra parte de la materia fecal se colocó en solución acética
formolada para realizar un nuevo examen parasitológico. Para
visualizar amebas se realizaron exámenes con tionina o lugol y con
coloraciones permanentes, hematoxilina-eosina o tricrómica de
Wheatley. También se investigó la presencia de otros protozoarios y
de helmintos.
La tercera parte de la muestra fecal se utilizó para coprocultivo. Se cultivó en agar-Mc-Conkeysorbitol y en agar-Salmonella-Shigella incubados 18- 24 h, a 37 ºC. La identificación de Salmonella spp. y Shigella spp.
se realizó mediante pruebas convencionales y la caracterización
serológica con sueros polivalentes (Administración Nacional de
Laboratorios e Institutos de Salud "Dr. Carlos G. Malbrán"). Para Campylobacter sp
se empleó medio de Skirrow modificado, en microaerofilia a 42 ºC
durante 24-48 h, para la generación de la atmósfera se empleó una
mezcla de gases (nitrógeno 85%, dióxido de carbono 10% y oxígeno 5%)
en jarras anaeróbicas. Se realizaron reacciones de catalasa, oxidasa,
hidrólisis de hipurato y examen microscópico.
Análisis estadístico: se realizaron comparaciones de proporciones entre algunos grupos mediante la prueba de Χ2
o exacta de Fisher, según correspondiera. En todos los casos, se
adoptó un nivel de significación α= 0,05. Los programas empleados
fueron el SPSS 17.0 y Epi-info 6.0.
RESULTADOS
Entre marzo de 2005 y noviembre de 2007, del total de 1.210
pacientes que consultaron en la guardia del Hospital por disentería,
181 tuvieron diagnóstico presuntivo de disentería amebiana
(Departamento de Estadística del Hospital), 89 de ellos fueron
captados por los investigadores para recolectar una nueva muestra
fecal. De estas, 14 fueron desechadas por dudas sobre la temperatura
de almacenamiento del espécimen. La muestra estuvo constituida por
75 pacientes.
Del total de casos estudiados, 35 fueron varones
y 40 mujeres, con un intervalo etario de 4 meses a 14 años y una
edad promedio (mediana) de 3 años.
Todos presentaron diarreas
agudas, el 72% con menos de 3 días de evolución. En 42 de 73
pacientes se constataron vómitos (en 2 no se registró la existencia del
síntoma). En 57 de 62 hubo dolor abdominal y en 13 lactantes no se
pudo precisar el síntoma. En 58 de 73 se constató fiebre (en 2 no
se registró el síntoma). En 55 de 75 se observó, macroscópicamente,
sangre en heces (73%) y en 20 se identificaron hematíes al examen
microscópico (27%). En todas las muestras fecales hubo leucocitos.
En la comparación de los datos clínicos comunicados para los grupos adhesina Eh positiva y negativa, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos síntomas.
Resultados de la prueba de adhesina De los 75 casos, sólo 28% tuvieron la prueba para E. histolytica positiva (adhesina Eh
positiva), con lo cual cabría esperar una prevalencia entre el
18% y el 38% de casos positivos en la población (IC 95%:
0,179-0,381).
Entre los casos adhesina Eh positiva se realizaron coloraciones permanentes a todos (n: 21) y en 10 (47,61%) se confirmó E. histolytica, 8 fueron trofozoítos y 2 quistes.
En tres niños se diagnosticaron trofozoítos hematófagos, 2 en el
examen directo y 1 con coloración permanente. Sólo en uno se halló E histolytica exclusivamente; en otro, se asoció con Giardia lamblia y en el restante, con Shigella flexneri de tipo S2.
Se realizaron coprocultivos en 15 casos (en 6, la muestra no fue enviada para cultivo). En 5, desarrolló Shigella flexneri de tipo S2; en 1, Escherichia coli enteropatógena (EPEC) y en 9, no se encontraron bacterias invasivas.
Se identificaron parásitos asociados en seis casos: Blastocystis hominis (5) y Giardia lamblia (1).
En los 54 casos del grupo adhesina Eh
negativa se realizaron coloraciones permanentes a 48 de ellos; en
6 casos, las muestras no se conservaron en forma correcta para
realizar las coloraciones.
Se identificó Entamoeba histolytica/dispar en 9 (19%) de los preparados (6 trofozoítos y 3 quistes).
Se encontraron parásitos asociados en 12 casos: B. hominis (9); Ascaris lumbricoides (1); Hymenolepis nana (1) y Entamoeba hartmani (1).
Se obtuvieron coprocultivos en 44 de los 54 casos mencionados (en
10 casos no fue conservada la muestra para efectuar cultivo
bacteriano).
En los cultivos de 22 de los 44 niños estudiados hubo desarrollo de enterobacterias invasivas: Shigella flexneri de tipo S2 (13); Shigella sp (1); Campylobacter jejuni (5); Salmonella thiphymurium (1); Salmonella sp (1); y ECEP (1).
En un paciente se diagnosticó: "trofozoítos hematófagos" en el
examen directo de materia fecal, pero no se encontraron amebas con
las coloraciones, la adhesiva fue negativa y desarrolló Shigella flexneri de tipo S2 en el cultivo.
Del total de 75 pacientes con presuntas disenterías amebianas, en
79% se completaron coprocultivos y en 47,5% de ellos se
identificaron bacterias invasivas, de las cuales, Shigella spp. fue la más frecuente (34%).
DISCUSIÓN
Hasta ahora, se ha considerado que la amebiasis intestinal invasiva
es frecuente en la Región centro-norte de la Provincia de Santa Fe.
Esta región incluye a los departamentos de los nodos de Salud:
Rafaela, Reconquista y Santa Fe. Habitan alrededor de 1.300.000
personas, de las cuales 18% no poseen cañerías de agua potable en sus
casas y 19% no tienen retretes con descarga, según datos del IPEC
(Instituto Provincial de Estadística y Censos) estimados al 30 de
junio de 2007.
Estudios realizados en otros países demostraron
que, en zonas con alta prevalencia de amebiasis, la mayoría de los
individuos parasitados son portadores asintomáticos de E. histolytica y de E. dispar. La capacidad de E. histolytica
para provocar disentería e infecciones extraintestinales es
reconocida, pero en la mayoría de los casos las infecciones por
este protozoario son asintomáticas.
Para ejercer su patogenia, los trofozoítos de la ameba patógena
se adhieren a las células del colon por medio de una proteína de
superficie, la lectina de adhesión de galactosa llamada adhesina,
para luego liberar enzimas que causan daño tisular. Petri y col.
(1987) lograron, mediante anticuerpos monoclonales, aislar la lectina
capaz de ser inhibida por la galactosa de E. histolytica y, de este modo, diferenciar la de E. dispar, incapaz de producirla.
Este tipo de prueba, al ser comparada con cultivos amebianos y con
análisis de zimodemos, demostró una sensibilidad de 96,9% y una
especificidad de 100%, con valor predictivo positivo de 100% y
negativo del 96,8%.
La observación microscópica de la materia fecal es el examen más
empleado para el diagnóstico de la amebiasis intestinal. Cuando en
una muestra diluida con solución fisiológica se identifica un
trofozoíto que forma seudópodos con rapidez, se mueve en una
dirección y tiene hematíes en su citoplasma, puede afirmarse que se
trata de un ejemplar de Entamoeba histolytica, sin necesidad de recurrir a pruebas diagnósticas más onerosas.
Pero este examen directo tiene limitaciones en cuanto a la
recolección de la materia fecal y la necesidad de contar con un
observador avezado.
Si la muestra diarreica no se examina
rápidamente los trofozoítos se desintegran. Para conservarlos
deben emplearse fijadores y luego realizar coloraciones permanentes.
En este trabajo, únicamente en tres niños con adhesina-positiva
pudo demostrarse la presencia de trofozoítos hematófagos de E. histolytica, en dos con el examen directo y en un tercero, con la coloración permanente; sólo en éste fue patógeno único.
Al considerar las coloraciones permanentes, pudo corroborarse la existencia de Entamoeba histolytica/dispar en casi la mitad de los casos adhesina- positiva, las que deben considerarse realmente como E. histolytica.
Las amebas halladas en la quinta parte de los casos
adhesina-negativa, al no producir la adhesina, pudo demostrarse que
eran E. dispar.
Cuando se informó E. histolytica/dispar
en el examen directo, el ELISA fue negativo y no se detectaron
amebas con las coloraciones, caben dos posibilidades: el conservante
no fue lo suficientemente eficaz o nunca fueron amebas. No sería
arriesgado conjeturar que pudieran confundirse glóbulos blancos con
trofozoítos pues se ha demostrado la posibilidad de sobrediagnóstico
de amebiasis por confusión con leucocitos.
Al respecto, dice Fonte Galindo: "…pueden confundirse con mucha
frecuencia trofozoítos amebianos con leucocitos, de manera particular
con macrófagos que han fagocitado hematíes y quistes de unas
amebas con otras, lo que conduce -en no pocas ocasiones- a resultados
falsos positivos". El comienzo agudo, la fiebre y presencia de leucocitos fecales
son datos que hacen presumir una disentería por bacterias (Shigella, Salmonella, Campylobacter, Escherichia coli enteroinvasiva).
En todos los niños estudiados, las muestras fecales observadas
con el microscopio presentaron hematíes y leucocitos, y en casi la
mitad de los coprocultivos realizados, desarrollaron bacterias
invasivas (Shigella flexneri, la más frecuente).
Al comparar los dos grupos, según la presencia de la adhesina de E. histolytica,
no se demostraron diferencias cuando se analizaron los síntomas
clínicos. Este hecho, sumado a la presencia de leucocitos en heces,
hace suponer que fueron las bacterias los agentes etiológicos más
significativos en estos niños con disentería.
Que fueran
encontrados, además, otros parásitos en la cuarta parte del total de
pacientes investigados, puede ser considerado como un marcador de
que la población estudiada estaba expuesta a condiciones de mal
saneamiento ambiental.
Se señala, como una restricción, el no haber podido efectuar la investigación de Escherichia coli
productora de shiga-toxina en niños con diarreas sanguinolentas. En
el diseño del trabajo no se consideró la evaluación de tratamientos.
CONCLUSIÓN
En este grupo de niños santafesinos con diarreas (supuestas
"disenterías amebianas"), se constató que sólo el 28% realmente tenía
E. histolytica en heces, con lo cual cabría esperar una
prevalencia de entre el 18% y el 38% de casos positivos en la
población [IC 95% (0,179; 0,381)].
En alrededor de la mitad de los casos se identificaron bacterias invasivas y la más frecuente fue Shigella flexneri de tipo S2.
Puede decirse, que de cada diez pacientes con diagnóstico de "disentería amebiana", sólo tres tuvieron E. histolytica en su materia fecal y que, de estos, sólo en uno fue patógeno único.
Se concluye que entre los pacientes que consultan por disentería
en el Hospital de Niños de Santa Fe, más allá de la necesidad de
precisar el diagnóstico de amebiasis, corresponde primero,
sospechar causas bacterianas.
Sobrediagnóstico microscópico de amebiasis intestinal. Resultados de
una encuesta aplicada a responsables de laboratorios de la provincia de
Cienfuegos.
INTRODUCCION
En el último decenio se acumularon evidencias que han llevado a considerar la Entamoeba histolytica
como un complejo de 2 especies morfológicamente idénticas, pero con
diferente patogenicidad, Entamoeba histolytica, (Schaudinn, 1903) y
Entamoeba dispar (Brumpt, 1925). A pesar de ello, la
observación microscópica de heces continúa siendo la prueba de
laboratorio más ampliamente utilizada para el diagnóstico de la
amebiasis intestinal.
Este proceder tiene 2 limitaciones adicionales: primero, la excreción intermitente de quistes de E. histolytica
hace necesario el estudio de al menos 3 muestras fecales en días
diferentes con el fin de reducir el número de falsos diagnósticos
negativos. Segundo, la diferenciación de E. histolytica de otras células en heces es un proceso tedioso que frecuentemente conduce a falsos diagnósticos positivos.
En 1988, Luaces y Barret describieron una proteasa de E. histolytica a la que denominaron histolisina. Posteriormente, Luaces et al.6
desarrollaron un ensayo inmunoenzimático (ENZYMEBA) para la detección
de esta enzima (renombrada histolisaina a partir de este trabajo) en
heces. La eficacia de este procedimiento fue probada en un estudio
realizado en Mérida, México (comunicación escrita, Comisión de Expertos
de la Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, México, 1992).
Teniendo
en cuenta las ventajas de ENZYMEBA, en especial el hecho de que sus
altos índices de sensibilidad y especificidad no dependen de la
subjetividad asociada a un observador,6 decidimos demostrar con
precisión la presencia del sobrediagnóstico de amebiasis intestinal
asociado al examen microscópico de heces en la provincia de Cienfuegos.
Al mismo tiempo, y este es el objetivo principal de este trabajo,
quisimos incursionar en los factores que podrían estar incidiendo en la
calidad del trabajo de los técnicos que realizan el diagnóstico
parasitológico por observación microscópica de heces. Para ello,
aplicamos una encuesta a los responsables de laboratorios de aquella
provincia, sobre aspectos técnico-organizativos relacionados con este
tipo de diagnóstico.
MÉTODOS
1. Muestras de heces
Durante
5 meses se colectaron en los Hospitales Clinicoquirúrgicos "Gustavo
Aldereguía" y Pediátrico "Paquito González" de Cienfuegos y en
prácticamente todos los policlínicos (13 de 14) de aquella provincia,
muestras fecales en las que habían sido detectados por observación
microscópica uno o más estadios de E. histolytica. En todos los casos, E. histolytica fue
identificada en las condiciones en que regularmente se realiza el
diagnóstico parasitológico por examen morfológico de heces en dichos
centros asistenciales.
Todas las muestras fueron
conservadas, congeladas, en las respectivas instituciones en que se
realizó el diagnóstico primario. De éstas fueron transportadas, también
congeladas, al Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de la
provincia Cienfuegos y de allí, en iguales condiciones, al Instituto de
Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).
2. Ensayo inmunoenzimático en fase sólida para la detección de histolisaina, proteasa de E. histolytica (ENZYMEBA)
La
prueba ENZYMEBA, en su forma de juego diagnóstico comercial producido
en el IPK, fue utilizada siguiendo las instrucciones del productor,
basadas en el procedimiento descrito por Luaces et al.6
3. Encuestas a responsables de laboratorios de la provincia Cienfuegos
El
cuestionario dirigido a responsables de laboratorios, preparado para
ser aplicado al universo de éstos en la provincia Cienfuegos, recogió
los datos generales y obtuvo información sobre aspectos técnico y
organizativos en relación con la calidad del diagnóstico parasitológico
de los técnicos que dirigen. Para la confección de este instrumento, que
se aplicó durante el mes de septiembre de 1996, se tuvo en cuenta,
además de las intenciones arriba mencionadas, la experiencia acumulada
en este tipo de encuestas en el Departamento de Parasitología del IPK y
las opiniones de especialistas relacionados con el tema en cuestión.
Una
vez confeccionado el cuestionario (11 preguntas), éste fue sometido a
criterio de expertos. No se consideró necesaria la preparación de un
instructivo para su aplicación porque esta actividad fue realizada
directamente por los autores.
4. Análisis estadístico
Se
realizó un análisis de comparación de proporciones para comprobar la
existencia o no de diferencia estadísticamente significativa entre la
eficiencia del diagnóstico en hospitales y policlínicos.
Empleando
el programa EPI-INFO, versión 6.0, se confeccionó una base de datos con
toda la información obtenida de la aplicación del cuestionario y se
realizó un análisis de frecuencia de las respuestas dadas en las que se
utilizó el mismo programa.
RESULTADOS
Se colectaron
en los 8 municipios de la provincia Cienfuegos un total de 448 muestras
de heces en las que habían sido detectados por examen microscópico 1 o
más estadios de E. histolytica. Veinticuatro de ellas fueron descartadas por no haber sido transportadas en condiciones de congelación.
La
tabla muestra los resultados del estudio de la eficacia del diagnóstico
morfológico en la provincia Cienfuegos. Como puede observarse, de las
424 muestras finalmente incluidas en el estudio, sólo 61 (14,4 %) fueron
positivas a ENZYMEBA. No se observaron diferencias estadísticamente
significativas entre la calidad del diagnóstico en los hospitales (18,2 %
de eficacia) y la de los policlínicos (13,8 %) (p > 0,05).
Tabla.
Resultados de la aplicación de ENZYMEBA a muestras de heces positivas a
E. histolytica por examen microscópico en hospitales y policlínicos de
la provincia Cienfuegos.
| No. de muestras | ENZIMEBA positivas | % |
| Hospitales | 55 | 10 | 18,2 |
| Policlínicos | 369 | 51 | 13,8 |
| Totales | 424 | 61 | 14,4 |
Fueron
encuestados los 16 responsables de laboratorios previstos, es decir, el
universo de jefes de estos servicios en la provincia Cienfuegos. El
instrumento aplicado demostró dificultades técnicos organizativas y
deficiencias materiales para el desarrollo del diagnóstico
parasitológico en los centros asistenciales de la provincia. En este
sentido los problemas más notorios fueron los siguientes:
- Sólo
9 (56,6 %) de los encuestados refirieron que en el laboratorio a su
cargo el diagnóstico parasitológico era realizado por un técnico que
llevaba a cabo esta actividad permanentemente y cuando era realizada de
manera rotatoria, en 11 de los casos la frecuencia de rotación fue
mensual o mayor.
- En sólo 4 (25 %) de las unidades
asistenciales de la provincia, el técnico que hace el diagnóstico
parasitológico realiza éste como única actividad.
- La
inmensa mayoría de los responsables encuestados (93,3 %) considera que
en sus respectivos laboratorios carecen de suficientes materiales
técnicos para posibles consultas (manuales, gráficos, esquemas u otros).
- De los encuestados, 11 (68,9 %) y 14 (87,5 %)
manifestaron que en sus unidades no se realizan controles de calidad
internos y externos, respectivamente.
- En relación con las
muestras de referencias necesarias en cada laboratorio en que se
realicen diagnósticos parasitológicos, sólo 2 (12,5 %) de los
responsables encuestados dijeron poseerlas en sus centros.
- Para
el diagnóstico parasitológico por observación microscópica se posee un
técnico entrenado que realiza solamente esta función en 4 (25 %) de los
centros de salud de la provincia.
DISCUSIÓN
De
las 424 muestras finalmente incluidas en el estudio, sólo 61 (14,4 %)
fueron positivas a ENZYMEBA. Este resultado nos demuestra que existe un
marcado sobrediagnóstico de amebiasis intestinal en la provincia
estudiada. Aunque no con la intencionalidad ni con las herramientas del
presente trabajo, un estudio muy reciente7 demostró que en otra
provincia de nuestro país, Ciudad de La Habana, también existe
sobrediagnóstico de esta parasitosis. Este problema, que conduce al uso
innecesario e yatrógeno de drogas amebicidas, se reporta cada vez con
más frecuencia más allá de nuestras fronteras.2,3,8
Para
incursionar en los factores posiblemente asociados a este
sobrediagnóstico de amebiasis intestinal por examen microscópico de
heces, aplicamos a los responsables de laboratorios de la provincia de
Cienfuegos un cuestionario sobre aspectos técnico-organizativos
relacionados con este tipo de diagnóstico.
El conjunto de
los resultados obtenidos de la aplicación de este cuestionario a los
responsables de laboratorio de la provincia Cienfuegos nos sugiere que
posiblemente en el marcado sobrediagnóstico de amebiasis intestinal
demostrado en este trabajo inciden, entre otros factores, deficiencias
tecnicoorganizativas y materiales. Una encuesta a los técnicos de
laboratorio de aquella provincia, aplicada de manera paralela a este
trabajo, reveló algunas de las dificultades aquí descritas (publicación
en preparación).
Dada las consecuencias yatrógenas y
económicas que el sobrediagnóstico de amebiasis intestinal puede tener y
el hecho de que la observación microscópica de heces continuará siendo
una herramienta indispensable en el diagnóstico de ésta y otras
parasitosis, los autores de este trabajo consideramos que, adecuándose a
las características propias de cada centro, se debe actuar sobre los
factores objetivos y subjetivos que posibilitan las dificultades
evidenciadas por este estudio.
En la Provincia Cienfuegos,
como probablemente ocurra en otras zonas del país, el diagnóstico de
amebiasis por examen microscópico de heces, se asocia a una proporción
significativa de falsos positivos (sólo el 14,4 % de las muestras
microscópicamente positivas a este protozoo, lo fueron también a
ENZYMEBA, procedimiento de probada certeza diagnóstica).
Como
lo comprobaron las encuestas realizadas a responsables de laboratorio,
en la eficiencia de los técnicos a cargo del diagnóstico parasitológico
inciden dificultades tecnicoorganizativas tales como las que fueron
expresadas en el cuerpo de este trabajo.
